内皮抑素及血管生长因子与川崎病的关系

    川崎病（Kawasaki disease，KD）又称皮肤粘膜淋巴结综合征，1967年由日本人川崎首次报道。是一种病因不明的急性自限性全身血管炎性疾病，免疫损伤性血管炎是川崎病的显著特征，主要累及中小动脉，特别是冠状动脉，主要并发症是冠状动脉损害（Coronary artery lesions,CAL），部分患儿形成冠状动脉瘤，甚至发生狭窄或血栓导致心肌梗死。近年来KD的研究已成为重点，KD的病因及发病机制尚未研究清楚，但是研究显示血管内皮损伤因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）与内皮抑素（Endostatin，ES）水平在KD的发生发展中存在浓度变化，但二者是否在冠脉损害病变的发生发展中起作用，以及在血管损伤过程中起保护机制，还是损伤机制，目前还存在较大争议。目前对于二者平衡关系的维持与打破在KD冠脉损害的研究也正在进行。本文对内皮抑素及血管生长因子与川崎病的关系作一综述。

    1.血管内皮生长因子（VEGF）及内皮抑素概况

    1.1 血管内皮生长因子

    血管内皮生长因子（VEGF），于1989年Ferrara N等在牛垂体滤泡星状细胞培养液中采用硫酸铵析出、肝素琼脂糖亲和层析法及两次反相高压液相色谱纯化得到的一种糖蛋白，早期被称为血管通透因子（vascular permeability factor，简称：VPF）。VEGF蛋白是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子（heparin-binding growth factor），刺激血管内皮细胞增殖和血管的发生，提高单层内皮的通透性，可在体内诱导血管新生（induce angiogenesis in vivo）。目前发现血管内皮生长因子家族共有七个成员，即VEGF-A、-B、-C、-D、-E（病毒性VEGF类似物）、-F（蛇毒VEGF）及胎盘生长因子。

    VEGF是高度保守的同源二聚体糖蛋白，两个亚基以二硫键组成的同源二聚体，亚基分子量分别为18kDa和24kDa。VEGF分解的单体无活性。人的VEGF基因位于染色体6p21.3，由8个外显子和7个内含子组成，编码的VEGF基因长约14kb，由于mRNA剪切方式的不同，可分别产生VEGF-121、VEGF-145、VEGF-148、VEGF-165、VEGF-183、VEGF-185、VEGF-206至少7种蛋白形式。不同的组织含有不同种类、比例的异构体，目前无论是在正常组织还是病理组织中，都以VEGF165的表达最高，提示VEGF165的作用可能更广泛，是其生物学作用的主要形式。VEGF受体作为酪氨酸激酶受体（PTKR）家族中的成员，共有三种，即VEGFR1（Flt-1） 、VEGFR2（Flt-2）和VEGFR3（Flt-3）。受体1和受体2主要分布在血管上，而受体3主要存在与淋巴管上，同时发现在肿瘤细胞上也存在相应受体，在调节血管、淋巴管的形成以及血管通透性等方面各有特点。

    VEGF是一种具有诱导内皮细胞增生和改变微血管通透性等多种功能的细胞因子。而多种信号分子包括低氧、肿瘤坏死因子、NO 、成纤维细胞生长因子、白细胞介素-1及胰岛素样生长因子等均能诱导VEGF的产生。VEGF的作用：除了能刺激内皮细胞产生超氧化物及一氧化氮而导致血管功能障碍以外，还能促进单核细胞经内皮移行等其他功能。VEGF主要在血管炎症时释放，能够诱导间质胶原酶、金属蛋白酶和纤维蛋白溶酶原激活剂的生成，活化纤溶酶原，加速小静脉和毛细血管出现裂隙，从而增加血管通透性，是潜在的单核细胞化学趋化因子，诱导内皮细胞黏附分子表达，可以造成周围血管水肿；同时还能够刺激内皮细胞的增殖、迁移和体内血管的形成，参与恢复期受损血管的重塑。

    1.2 内皮抑素（ES）

    内皮抑素是1997年O'Reilly等从培养的小鼠内皮细胞瘤（EOMA）上清中分离纯化的一种内源性血管生成抑制剂。氨基酸序列分析显示：ES共有184个氨基酸，酸性氨基酸16个，碱性氨基酸29个，疏水氨基酸占42%，为20kd分子量蛋白质。内皮抑素对肝素有高亲和力，进一步研究分析发现：内皮抑素结构表面有一肝素结合位点，由11个精氨酸残基组成的碱性区域，可能是通过该区域与血管生成因子竞争结合肝素，起到抑制血管生成作用。但也有学者认为ES与血管壁的结合不依赖于肝素结合位点，且与FGF-2无竞争性抑制作用。此外，在内皮抑素序列中发现有一锌离子结合位点，锌与内皮抑素的N 端环绕形成一个二聚体结构。但后来通过进一步研究表明，内皮抑素发挥功能，抑制肿瘤的生长和内皮细胞的迁移并不依赖锌离子结合位点。内源性内皮抑素在人体多种组织中均可以提纯得到，如大脑、心脏、肝脏、睾丸、骨骼肌、肾脏，在胚胎组织中同样有内皮抑素的表达。

    内皮抑素是目前发现的最有效抑制血管生成的物质，其抑制血管形成作用大概是血管抑素的30倍，现今在遏制肿瘤生长方面研究的最广泛，尤其是非小细胞肺癌的研究。

    （1）内皮抑素对血管内皮细胞（EC）的抑制作用：ES能特异性抑制EC在碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导下的增殖，抑制EC的迁移，诱导EC凋亡。还可以诱导EC周期停滞从而对EC起抑制作用。还有研究指出ES可启动内皮细胞的自吞噬死亡程序而致细胞死亡。但杨荻等人通过ES对血管内皮细胞进行增殖抑制发现，在形态学上未见细胞形态的明显改变，也未见到凋亡小体等特征性表现，因此认为ES并没有启动细胞内皮细胞凋亡，仅限于抑制血管内皮细胞的增殖。

    （2）内皮抑素对血管生成的抑制作用：内皮抑素可以从源头调节新生血管的生成，可以对有关细胞增殖的基因起快速负调节作用。内皮抑素可以与VEGF相关受体结合，抑制VEGF介导的生长通路。有研究显示ES能通过抑制内膜血管新生起抑制冠脉粥样硬化的作用，从而增强冠脉稳定性，对急性冠脉综合征有一定的防止作用。

    （3）内皮抑素对肿瘤生长和转移的抑制作用：国内外许多学者利用重组内皮抑素蛋白或通过内皮抑素基因治疗实验表明，内皮抑素对多种实体瘤的生长和转移都能产生抑制作用。有研究报道指出内皮抑素能够通过抑制机制金属蛋白酶的活性阻碍肿瘤的侵袭转移，也可以直接作用于肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞侵犯血管。Isayeva等研究了Endostatin基因对鼠卵巢癌模型的抑制作用，结果显示可以有效地抑制卵巢癌的生长与转移。

    我国已于2005年批准人重组内皮抑素（恩度，YH216）进入临床使用。现目前除了抗癌作用外，ES也在其他有血管增生的疾病如：类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病变、牛皮癣及动脉硬化中取得了一定成果。而ES在临床科研方面的研究需要我们进一步的探索实践。

    2.VEGF与ES的关系

    VEGF与ES作为血管新生的正负调控因子，现目前在血管新生以及肿瘤研究方面比较广泛。促进血管新生的主要正调控因子是VEGF与bFGF,还包括血小板源生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）及表皮细胞生长因子（EGF），而负调控因子就包括了我们在此讨论的ES，还有血管抑素、血小板因子、α和β干扰素等等。VEGF的生成可以刺激ES的产生形成，但ES主要是拮抗VEGF对内皮的作用，选择性调节内皮细胞功能，特异性抑制内皮细胞增殖，有效抑制血管生成；还有一些血管生成抑制剂，如Avastin（阿瓦斯丁）也可以起到下调VEGF的作用。ES能通过下调肿瘤细胞VEGF mRNA及蛋白质的表达而影响内皮细胞上一氧化氮合成酶的活性，减少VEGF诱导生成一氧化氮，进一步抑制了VEGF介导的血管形成和内皮细胞迁移。也有学者认为内皮抑素可能与一些细胞因子（如VEGF和bFGF）竞争细胞表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白结合位点，抑制内皮细胞增殖而起到血管抑制作用的机制。

    在多种恶性病，如软组织肉瘤，肾癌，乳腺癌，非霍奇金淋巴瘤中，VEGF 、ES浓度水平都会增加。在关于VEGF,ES与冠心病的研究中指出由于缺血、缺氧等诱因触发血管新生的同时，胶原XⅧ等前体蛋白也被水解为ES，从而抑制新生血管的过度形成。在急性淋巴细胞白血病（AL）中研究指出：AL患者中血清VEGF、ES水平异常增高，提示VEGF、ES与AL的发生发展有关，化疗后（完全缓解）血清VEGF、ES水平及V/E比值均下降，而未缓解患者无下降，提示血清VEGF、ES水平及V/E比值可作为疗效观察指标。另有报道指出，在风湿性关节炎中，病人血清及关节液采样中有高浓度水平的VEGF，但ES水平正常，从而表明在VEGF与ES的产生中出现了不平衡。VEGF与ES二者平衡关系的维持与打破是否在多种疾病的发生发展中存在关系，有待与更多的深入研究。

    3.VEGF在川崎病冠脉损害中的研究

    KD的主要病理特征为全身性非特异性血管炎症。川崎病的急性期体征，如手足末梢硬性水肿，皮疹，黏膜充血等和有部分患者出现的低蛋白血症，被认为是血管渗漏导致的结果，因而认为血管通透性增加可能是KD早期病理机制的一个重要特征。VEGF能通过诱导相关酶原激活剂的生成增加血管通透性，并通过影响毛细血管后静脉和小静脉增加血管通透性，在KD急性期加强血管壁破坏，参与血管炎症。有报道显示在KD患儿的急性期，出现了VEGF浓度水平的异常增高；有冠脉扩张者更加明显，且与冠脉损害程度有关。Suzuki等对KD患儿的心内膜心肌活检和尸检标本研究发现，VEGF及其受体在心肌细胞，微血管的内皮细胞和平滑肌细胞中广泛表达，其表达程度与心肌细胞变性及微血管扩张密切相关，提示VEGF参与KD动脉血管损伤的致病过程。

    沈捷等研究发现KD组VEGF含量在治疗前后均明显高于对照组。在KD早期，VEGF作为一种炎症细胞因子，参与了其病理生理过程。但研究显示VEGF含量在CAL组和NCAL组之间没有差别，也没有观察到冠脉扩张患儿VEGF与冠脉直径的相关关系。这与之前的研究报告有出入，沈捷等人分析可能是观察的CAL组多为轻度一过性冠脉扩张，所以未能出现如前述研究结果。

    VEGF水平在川崎病发生发展过程中存在一定变化，但对受损血管是一种保护机制，还是损害机制，现今仍存在较大争议。张园海等通过对48例KD患儿的观察研究发现：KD急性期血清VEGF含量高于KD缓解期及正常对照组（q<0.01）；KD缓解期血清VEGF含量下降，但仍较对照组高。急性期患儿血VEGF与CRP水平存在显著正相关（r=0?615,P<0?01）。提示在KD发病过程中，VEGF参与了KD早期血管损伤过程；与国内外相关报道一致。但研究数据显示KD急性期NCAL组VEGF含量明显高于CAL组（q=0.615,P<0.01），提示VEGF对损伤的冠状动脉壁有修复作用，在KD急性期不能产生足够VEGF的患儿可能形成冠状动脉损害。

    Tera iM 等观察到，KD急性期明显升高的VEGF，在IVIG治疗后不仅没有下降，反而更高； 有研究者认为VEGF可能是对炎症血管的一种保护反应。在川崎病炎症的恢复过程中，减轻组织水肿，淋巴管道的形成起到了不可或缺的作用。尽管VEGF-D的具体生理机制还不清楚，但其在淋巴系统的发生发展中是必不可少的。研究显示在KD患儿心肌组织中的淋巴管道横断面积有所增加，而在这些增大的淋巴管内皮细胞上可以测出VEGF-D蛋白的表达。Ebata等通过对VEGF-D与淋巴管生成的研究指出：KD的急性期施以丙种球蛋白治疗后，血清VEGF-D水平会有所增加；但冠脉损伤组VEGF-D水平明显低于非冠脉损伤组（P<0.05）。

    研究表明：在KD中，VEGF-D产生的增加与淋巴管道的形成有关；低浓度的VEGF-D可能与CAL的形成有关。由此推断在后几位学者的研究中认为：VEGF在川崎病对受损血管所起的是一种保护机制。在研究血管内皮生长因子C与肿瘤的研究发现，VEGF-C能选择性的诱导淋巴管的增生，那么其是否与KD也存在一定关系，是否可以作为在川崎病研究中的一个新方向，也同样值得我们深入。

    我们有理由相信：在KD发病过程中，VEGF在KD血管损伤中存在一定作用，但纠起所起的是保护还是损害机制，可能在不同时期及不同状态下有不同的结局，具体的详细机制需要有更多的科学工作加以探讨论证。

    4.ES在川崎病冠脉损害中的研究

    内皮抑素是目前发现的最有效抑制血管生成的物质，通过抑制内皮细胞增殖，迁移，促进EC凋亡来抑制血管生成活动。现今关于ES单独在川崎病中的研究并不多，主要是VEGF、ES二者在KD中的研究。S. Takeshita等通过对35例川崎患儿的研究指出：相较于发热对照组及健康对照组，KD患儿在发病急性期及亚急性期VEGF明显增高，而ES明显降低（P<0.01）。在KD患儿中，相较于非冠脉损害组（NCAL，n=25），冠脉损害组（CAL，n=10）在亚急性期以及恢复期VEGF水平明显增高，而ES水平降低（P<0.05）。KD中CAL组血清中VEGF/ES比值在亚急性及急性期均明显高于NCAL组（P<0.05）。此外，在KD发病的亚急性期，CAL的发生率与VEGF/ES比值存在正相关（OR=17?25,P=0.005）。

    该研究报告认为，在川崎病发生发展过程中VEGF和ES的平衡关系被打破了，在KD血管炎中，下调ES水平可能通过VEGF作用促进EC迁移，增加新生血管形成。当川崎病患者出现高的VEGF/ES比值时，并发冠脉损害的可能性就会相应增加。KD的急性期，当VEGF显著升高时内皮抑素却显著降低，认为VEGF与ES之间存在动态平衡，VEGF/ES比值增加可能引起冠脉损伤。ES基因在人类基因组进化过程中长期存在，与肿瘤发生有着可能类似的调控机制，缺血心肌的血管新生也如此。可能是作为促进血管生长的代偿性反应，ES的生成是为了抑制促血管生成因子的过度作用以调节血管新生过程。正常情况下VEGF与ES的平衡被打乱以后，就可能出现新生血管的生长紊乱，出现血流动力学改变，血管内皮细胞损害。对于以全身血管炎为主要改变的川崎病，尤其是作为主要并发症的冠脉损害而言，VEGF、ES以及VEGF/ES改变的详细机制有待于进一步探讨。

    5.小结与展望

    现目前川崎病的病因及发病机制研究的很广泛，但是仍然没有一个统一的说法。但是大量研究表面VEGF，ES与川崎病的发病过程，以及与冠脉损害存在一定的关系。但就现在的研究而言，VEGF是作为KD中对受损血管的一种保护机制，还是损害机制，仍存在较大争议，需要更多的科学工作者进一步研究。最新研究指出VEGF-D在川崎病中主要是对淋巴管道形成的影响，但还需要更多的研究来阐述VEGF-D对KD结局影响的机制，VEGF-D有望成为一种新的生物监测指标，甚至有望成为一种新的治疗靶点。而VEGF-C在KD中的研究也是值得人们审视的一方面。作为起抑制血管生成作用的ES在KD的研究中还不成熟，需要进一步深入研究。VEGF/ES这种平衡关系的维持在KD中很重要，所以在临床上尽早监测到这种平衡的紊乱情况，以及尽早采取相应措施来维持这种平衡是进行KD治疗及预防冠脉损伤并发症的一个值得深入讨论的问题。